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多篇研究揭示Prickle1基因調節額骨成骨細胞分化

由于顱骨原基(skull primordia, 發育中的頭骨)中成骨細胞(osteoblast)的遷移和分化缺陷,囟門(fontanelle)增大和前額骨(frontal bone)變小可導致顱骨遭受機械損傷。Wnt/PCP信號通路通常在胚胎發育期間調節組織中的細胞遷移和運動。在近期的一項研究中

由于顱骨原基(skull primordia, 發育中的頭骨)中成骨細胞(osteoblast)的遷移和分化缺陷,囟門(fontanelle)增大和前額骨(frontal bone)變小可導致顱骨遭受機械損傷。Wnt/PCP信號通路通常在胚胎發育期間調節組織中的細胞遷移和運動。在近期的一項研究中,美國匹茲堡大學牙醫學院顱面再生中心的Yong Wan及其同事們著重研究了Prickle1基因,即顱骨中Wnt/PCP信號通路的一個核心組分。

在這項研究中,Wan等人使用了Prickle1的錯義等位基因,即Prickle1Beetlejuice(PrickleBJ)。純合的PrickleBJ/BJ 'Beetlejuice'突變小鼠(也稱為小鼠突變體,突變型小鼠)是小頭畸形的,并且在未充分發育的額骨之間形成增大的囟門,不過頂骨(parietal bone)是正常的。這些純合突變小鼠具有其他幾種顱面缺陷,包括中線唇裂,不完全滲透性腭裂和頭部近端-遠端生長減少。他們在這些純合突變小鼠的額骨凝聚區中觀察到下降的Wnt/β-catenin和Hedgehog信號轉導。相關研究結果已發表在Scientific Reports期刊上。

 

圖片來自Scientific Reports, doi:10.1038/s41598-018-36742-0。

 

在這些純合突變小鼠中,額骨成骨細胞前體細胞(osteoblast precursor)經歷了延遲分化和下降的遷移標志物表達,從而導致額骨發育不全。Wan等人發現Prickle1蛋白功能有助于骨形成細胞(即成骨細胞前體細胞)的遷移和分化,并且在這種突變動物模型中,它的缺失會導致缺陷。純合突變小鼠(PrickleBJ/BJ)出現心臟流出道錯位和腭裂,從而導致突變小鼠的圍產期死亡。因此,這些表型特征是從胚胎早期階段到胚胎晚期階段觀察到的。

從本質上講,顱面復合體(craniofacial complex)包含三個不同的區域:顱骨穹窿(skull vault)、顱底(cranial base)和面部。顱底骨骼通過軟骨內骨化(endochondral ossification)形成,而顱骨穹窿中的骨生成通過膜內骨化(intramembranous ossification)發生。顱骨穹窿和顱底都是胚胎起源的(起源自神經嵴或中胚層)。

在這種研究模型中,Beetlejuice突變小鼠(Bj)的Prickle1基因含有點突變(C161F),Bj C161F突變對細胞質蛋白Prickle1的功能有害。人體內這種蛋白發生的突變通常與家族性癲癇有關。這種突變體表型與Prickle1的另一個獨立點突變(C251X)一致,包括肢體發育不良和腭裂。盡管這個基因的蛋白產物在細胞質中廣泛表達,但是人們對它在顱面骨生成中的作用知之甚少。

在這項研究中,Wan等人使用阿爾新藍(alcian blue)和茜素紅(alizarin red)組織學染料分析頭部的骨骼和軟骨。這種純合突變小鼠的頭骨較小,而且頭部的近端-遠端長度隨著顱骨側方寬度的增加而減小。這些結果表明在野生型小鼠(Prickle+/+)中,鼻骨(nasal bone)對顱骨穹窿總長度的貢獻在統計學上顯著減少。

相反,在純合突變小鼠(PrickleBJ/BJ)中,額骨對頭部總近端-遠端長度的貢獻增加了,而頂骨作出的貢獻比例保持不變。總之,這些結果表明額骨發育的各個階段都需要Prickle1蛋白功能。

Wan等人通過研究這種蛋白在野生型小鼠胚胎和突變小鼠胚胎中的組織分布,著重關注Prickle1在發育中的顱骨穹窿中的功能。他們發現Prickle1突變導致額骨發育過程中的兩個過程存在缺陷,包括延遲的成骨細胞分化和它們在額骨中的遷移減少。在鎖骨顱骨發育不良(cleidocranial dysplasia, CCD)的表型譜中,也觀察到這些額骨缺損。

這種觀察到的額骨功能不全可能是由于增殖缺陷和細胞死亡造成的。Wan等人使用蘇木精和伊紅(H&E)組織學染料進行了研究,并通過觀察野生型小鼠與突變型小鼠在胚胎階段第12.5周(embryonic stage 12.5, E12.5)時的額骨凝聚區來測試這個假設,這是因為額骨凝聚區通常會在E12.5時形成。此后,他們進行了TUNEL凋亡測定,測定結果表明在不論是野生型還是突變型,存在著非常少的凋亡細胞。

這項研究包括對突變小鼠與野生型小鼠進行BrdU標記細胞計數,計數結果顯示增殖細胞所占的比例也沒有差異。隨后利用磷酸-組蛋白H3免疫組織化學方法對活躍分裂細胞的數量進行測試,結果表明在同窩出生的小鼠中,分裂細胞的數量不存在差異。鑒于細胞死亡和增殖沒有變化,Wan等人接下來決定測試成骨分化(osteogenic differentiation)是否正確發生。

為此,Wan等人進行了RNA原位雜交實驗,以評估額骨中的前成骨細胞(pre-osteoblast)和成骨細胞內的堿性磷酸酶(ALP)和Osterix(OSX,也稱為Sp7)表達。他們檢測到RUNX2和ALP的表達,其中RUNX2是額骨中成骨細胞定向分化的早期標志物,ALP是更成熟的成骨細胞的標志物。到胚胎階段第15.5周(E15.5)時,與野生型同窩出生小鼠相比,突變小鼠額骨外顱層中的Runx2、ALP和OSX表達下降了。他們確定額骨中延遲的膜內骨化(間充質組織轉化為骨)會導致發育不良的Beetlejuice突變體。

Wan等人通過研究小鼠突變體中經典Wnt和Hedgehog信號轉導的水平,進一步確定存在缺陷的信號轉導系統是否導致延遲的額骨骨生成。這些結果表明顱骨發育所需的Hedgehog信號轉導的水平確實在突變小鼠中是有缺陷的。

最后,他們在野生型和突變型同窩出生小鼠中進行了成骨細胞遷移標志物的原位雜交(標志物為Engrailed1、Twist1、Msx1和Msx2)實驗。在突變小鼠額骨原基中的標志物表達水平下降了。這些結果表明在顱骨穹窿發育的各個階段,Prickle1蛋白功能是介導成骨細胞前體細胞遷移所必需的。

通過這種方式,Wan等人分析了作為了解小頭畸形病因的一種新模型的Beetlejuice突變小鼠。目前用于確定小頭畸形中面部和顱骨生長模式的動物模型的數量是有限的。他們在研究中將與Prickle1突變體相關的遺傳、分子和物理機制結合在一起,發現這些Prickle1突變體導致這種新小鼠模型中的顱面部區域生長下降。

他們將繼續開展研究以便了解細胞遷移和每個區室(腦部、顱骨穹窿和顱底)的改變如何導致小頭畸形、顱骨模式化和生長。(生物谷 Bioon.com)

參考資料:

1.Yong Wan et al. Prickle1 regulates differentiation of frontal bone osteoblasts, Scientific Reports (2018). DOI: 10.1038/s41598-018-36742-0

2.Osteogenesis: The Development of Bones

3.Shiqin Zhang et al. Dose-Dependent Effects ofRunx2on Bone Development, Journal of Bone and Mineral Research (2009). DOI: 10.1359/jbmr.090502

4.Angel Pan et al. A review of hedgehog signaling in cranial bone development, Frontiers in Physiology (2013). DOI: 10.3389/fphys.2013.00061

5.S Mundlos et al. Mutations Involving the Transcription Factor CBFA1 Cause Cleidocranial Dysplasia, Cell (2004). DOI: 10.1016/S0092-8674(00)80260-3

 
 
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